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食管鳞状细胞癌中癌症相关成纤维细胞促进癌细胞侵袭和巨噬细胞迁移

在全球范围内,食道癌是第七大常见癌症。食管癌由两种主要的组织学类型组成,包括食管鳞状细胞癌(ESCC)和食管腺癌(EAC)。ESCC发生的重要危险因素包括饮酒、吸烟、高淀粉饮食等,但具体机制尚不清楚。


肿瘤微环境(TME)可以促进肿瘤进展。TME包括各种基质细胞,例如癌症相关成纤维细胞(CAFs),肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)、其他非恶性细胞,和细胞外成分(细胞因子、生长因子、细胞外基质等)。CAFs通过介导肿瘤增殖、迁移和侵袭的激活,以及诱导血管生成、刺激转移等在肿瘤进展中起关键作用。CAFs可能来源于骨髓源性间充质干细胞(MSCs)、常驻成纤维细胞、内皮细胞、脂肪细胞和上皮细胞。α-平滑肌肌动蛋白(αSMA)和成纤维细胞活化蛋白(FAP)是CAFs的代表性细胞标志物,其表达升高与几种癌症的预后较差有关。研究表明,CAFs通过与TME的其他基质成分(如TAMs)相互作用间接促进肿瘤进展。


在日本神户大学医学研究科团队先前的一项研究中,表征了ESCCCAFs的肿瘤促进能力和免疫抑制表型的机制。此外,在MSCsESCC细胞之间进行共培养测定,发现共培养的MSCsFAP表达增加。这些FAP阳性MSCs,实验将其定义为CAF样细胞,通过分泌C-C基序趋化因子配体2CCL2)和白细胞介素-6IL-6)来促进ESCC细胞和巨噬细胞的迁移能力,并诱导巨噬细胞的M2极化。然而,CAFsM2极化巨噬细胞(所谓的TAMs)和ESCC细胞之间的相互作用尚未详细阐明。


为了探索CAFs增强ESCC进展的机制,该团队在体外通过将MSCsESCC细胞共培养来建立CAF样细胞,通过cDNA微阵列分析比较了单培养MSCsCAF样细胞之间的基因表达谱,并表征了CAF样细胞对ESCC细胞和巨噬细胞的影响。此外,确定了ESCC微环境中CAF样细胞促进肿瘤作用的可能关键参与者,这些细胞可能被用作ESCC治疗的潜在靶点。


食管鳞状细胞癌中癌症相关成纤维细胞促进癌细胞侵袭和巨噬细胞迁移


MSCs CAF样细胞对PAI-1的表达


通过间接共培养法评估CAFsESCC微环境中的功能(图1 a)。在与三种TE-系列ESCC细胞:TE-8TE-9TE15细胞共培养的MSCs中诱导FAPmRNA和蛋白表达水平。接下来将与TE-8TE-9TE-15细胞共培养的MSCs分别定义为CAF样细胞:CAF8CAF9CAF15细胞(图1 a)。通过比较单培养MSCsCAF样细胞的基因表达谱,在CAF9中确定了110个上调的基因和128个下调的基因。热图显示了CAF9中上调基因中高表达的前50个基因(图1 b)。不同细胞组中CAF9CAF15的基因表达模式最为相似。单培养的MSCs具有与CAF样细胞不同的表达模式。


在这项研究中,重点研究了丝氨酸蛋白酶抑制剂E1SERPINE1),这是CAF样细胞中上调且高表达的基因之一(图1 b)。通过qRT-PCR证实了SERPINE1 mRNA以及IL6CCL2CXCL12 mRNACAF样细胞中的高表达水平(图1 c)。CAF样细胞分泌的PAI-1(纤溶酶原激活物抑制剂-1,由SERPINE1编码)的浓度明显高于单培养的MSCs(图1 d)。ELISA的结果验证了ESCC细胞,特别是TE-8TE-9细胞中PAI-1的分泌(图1 d)。



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1 PAI-1CAF样细胞中被诱导表达和分泌



针对PAI-1的中和抗体抑制CAF样细胞诱导的ESCC细胞迁移


CAF样细胞CAF8CAF9CAF15细胞共培养,分别显著诱导了3TE-系列ESCC细胞TE-8TE-9TE-15细胞的迁移和侵袭能力(图2 ab)。添加针对PAI-1的中和抗体显著抑制了与CAF样细胞共培养的ESCC细胞的迁移和侵袭能力(图2 cd)。


食管鳞状细胞癌中癌症相关成纤维细胞促进癌细胞侵袭和巨噬细胞迁移


2 CAF样细胞分泌的PAI-1促进ESCC细胞的迁移和侵袭



PAI-1通过激活AktErk1/2信号通路诱导ESCC细胞的迁移和侵袭


使用RT-PCR和蛋白质印迹法确认了PAI-1受体LRP1在三个TE-系列ESCC细胞中的表达(图3 ab)。为了研究PAI-1ESCC细胞表型和信号通路的影响,将rhPAI-1应用于TE-8TE-9TE-15细胞。rhPAI-1显著促进了ESCC细胞的迁移和侵袭能力(图3 cd)。此外,rhPAI-1促进TE-8TE-9细胞的迁移。rhPAI-1在处理1030分钟后增加p-AktSer473 / Thr308)和p-Erk1/2水平(图3 e)。PI3K抑制剂LY294002MEK1/2抑制剂PD98059抑制了rhPAI-1处理的ESCC细胞中迁移和侵袭的诱导(图3 fg)。



食管鳞状细胞癌中癌症相关成纤维细胞促进癌细胞侵袭和巨噬细胞迁移

3 PAI-1通过激活AktErk1/2信号通路促进 ESCC 细胞的迁移和侵袭



PAI-1促进ESCC细胞的迁移和侵袭,并通过LRP1激活信号通路


为了阐明PAI-1是否通过LRP1影响ESCC细胞的表型和信号传导,实验通过RNA干扰抑制了三个TE-系列ESCC细胞中的LRP1 mRNA。结果表明,敲低ESCC细胞中LRP1显著抑制了rhPAI-1诱导的迁移和侵袭。在ESCC细胞中LRP1敲低后,p-Aktp-Erk1/2水平降低。


PAI-1通过LRP1激活AktErk1/2信号通路诱导巨噬细胞的迁移和侵袭


实验通过与上述相同的方法证实了PAI-1对巨噬细胞的影响。与CAF样细胞共培养显著诱导巨噬细胞的迁移和侵袭。针对PAI-1的中和抗体显著抑制了CAF样细胞诱导的巨噬细胞迁移和侵袭。使用RT-PCR和蛋白质印迹证实了LRP1在巨噬细胞中的表达。研究发现rhPAI-1显著促进了巨噬细胞的迁移和侵袭能力,观察到rhPAI-1在处理10分钟后增加了巨噬细胞中的p-Aktp-Erk1/2水平。然而,rhPAI-1不影响巨噬细胞的M2极化。LY294002PD98059抑制了rhPAI-1诱导的巨噬细胞迁移和侵袭能力。接下来,通过RNA干扰抑制巨噬细胞中的LRP1 mRNA,发现巨噬细胞中LRP1的敲低抑制了rhPAI-1诱导的迁移和侵袭。PAI-1诱导的p-Aktp-Erk1/2的水平也因巨噬细胞中LRP1的敲低而降低。

PAI-1 LRP1 表达水平与 ESCC 患者的临床病理因素和预后相关


为了明确PAI-1LRP1的表达水平是否与ESCC患者的临床病理因素相关,实验对69例人ESCC组织中的PAI-1LRP1进行了免疫组织化学分析。根据PAI-1在基质细胞中的免疫反应性和LRP1在癌细胞(CA)或基质细胞(ST)中的免疫反应性将ESCC组织分为高表达组和低表达组(图4 abcd),并通过双重免疫荧光确认包括CD204+ TAMs在内的基质细胞在人ESCC组织中表达LRP1(图4 e)。研究发现PAI-1在肿瘤基质中的高表达水平与肿瘤浸润深度、αSMAFAP的高表达水平以及大量浸润的CD204+巨噬细胞密切相关。LRP1CA)的高表达水平与FAP的高表达水平和大量浸润的CD204+巨噬细胞显著相关。LRP1ST)的高表达水平与性别、肿瘤浸润深度、αSMAFAP的高表达水平以及大量浸润的CD204+巨噬细胞显著相关。


接下来,分析了PAI-1LRP1表达的预后值。分析显示,PAI-1LRP1ST)高表达水平的患者无病生存期(DFS)明显较短,LRP1CA)高表达水平的患者肿瘤特异性生存期(CSS)明显较短。PAI-1LRP1CA)或LRP1ST)表达对患者的总生存期没有显著影响。


接下来,根据PAI-1LRP1CA)免疫反应性评分的组合将患者分为三组。PAI-1LRP1CA)均高表达的患者与PAI-1LRP1CA)均低表达的患者相比,DFSCSS显著缩短。与PAI-1LRP1CA)表达水平低的患者相比,PAI-1LRP1CA)高表达水平的患者DFS明显较短。同样,根据PAI-1LRP1ST)免疫反应性评分的组合将患者分为三组。PAI-1LRP1ST)表达水平高的患者与PAI-1LRP1ST)表达水平低的患者相比,DFSCSS表达水平明显较短。此外,PAI-1LRP1ST)高表达水平的患者与PAI-1LRP1ST)低表达水平的患者相比,DFS明显较短。



食管鳞状细胞癌中癌症相关成纤维细胞促进癌细胞侵袭和巨噬细胞迁移


4 PAI-1LRP1在人ESCC组织中的表达



总之,该研究证明了来源于CAFsPAI-1通过与LRP1相互作用,通过AktErk1/2的磷酸化促进了ESCC细胞和巨噬细胞的迁移和侵袭。CAFs 中的 PAI-1 ESCC 患者的潜在预后因素。因此,靶向PAI-1/LRP1轴可能是ESCC的一种治疗方法。







参考文献:Sakamoto H, Koma YI, Higashino N, Kodama T, Tanigawa K, Shimizu M, Fujikawa M, Nishio M, Shigeoka M, Kakeji Y, Yokozaki H. PAI-1 derived from cancer-associated fibroblasts in esophageal squamous cell carcinoma promotes the invasion of cancer cells and the migration of macrophages. Lab Invest. 2021 Mar;101(3):353-368. doi: 10.1038/s41374-020-00512-2. Epub 2020 Dec 12. PMID: 33311557; PMCID: PMC7892342.


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