间歇压缩力诱导小鼠诱导型多能干细胞拟胚体中的细胞周期并减少细胞凋亡

诱导多能干细胞（iPSCs），可通过重编程体细胞（包括口腔组织细胞）产生，具有无限的自我更新特性，可以分化成任何类型的细胞和组织。因此，iPSCs被认为是一种很有前途的工具，不仅用于组织再生，而且通过体外制造三维（3D）组织/器官（类器官）进行疾病建模。

机械应力是iPSCs类器官形成的一种有前途的操作技术。机械力调节干细胞中的许多生物反应。机械刺激诱导iPSCs向骨和软骨细胞谱系分化和成熟。因此，机械力对干细胞反应的影响在很大程度上取决于与力和细胞相关的许多因素，包括力的类型、大小、持续时间、细胞类型和细胞阶段。

在口腔科学领域，间歇性压缩力（ICF）在与咀嚼、咬合或正畸治疗相关的细胞行为调节方面得到了特别好的研究。ICF调节许多信号通路并进一步影响各种细胞反应。因此，需要进行系统分析来研究ICF如何影响细胞反应。

已经在各种条件下研究了全局基因表达谱，以确定机械力调节的潜在途径。ICF处理的PDLCs在局灶粘附，肌动蛋白细胞骨架调节，TGF-β信号通路和细胞因子-细胞因子受体通路中显示出基因表达的显著变化。在这种情况下，开发有效的再生医学和工程细胞操作方法需要了解响应机械刺激的全局基因表达谱，特别是在能够在体外形成复杂类器官的iPSCs中。然而，ICF对iPSCs的影响仍然未知。

日本东北大学牙科研究生院、朱拉隆功大学牙科学院研究团队的一项研究旨在通过使用RNA测序进行全局基因表达分析，鉴定3D培养小鼠iPSCs中ICF调控的途径。

ICF处理的iPSCs的差异基因表达谱

将小鼠iPSCs形成的拟胚体进行总RNA分离以进行高通量RNA测序。ICF（1.5 g·cm^-2，0.23 Hz）处理24小时后，与未负荷对照相比，iPSC结构没有显著形态变化。与未负荷对照相比，ICF在24小时不影响细胞活力。ICF处理上调了893个基因，下调了1076个基因。差异调控基因在生物过程、细胞成分和分子功能上分别与代谢过程、膜和蛋白质结合有关。

基于蛋白质-蛋白质相互作用网络BIOGRID功能数据库进行基于网络拓扑的分析，丰富生物过程类别中的基因本体。上调基因的富集基因本体类别与细胞周期有关，而下调基因的富集基因本体类别与小分子和辅助因子代谢过程相关。

ICF 影响 iPSCs 中的 p53 和细胞周期通路

使用KEGG数据库进行的生物信息学分析揭示了ICF调控的几种通路。上调基因参与p53信号通路和FoxO信号通路，而下调基因参与HIF-1信号通路。与对照组相比，p53信号通路中的20个基因（图1 a）和细胞周期通路中的11个基因（图1 b）在ICF处理中差异表达。图1 a所示的20个差异表达基因均分布在p53信号通路KEGG数据库的通路图（map04115）中，表明ICF影响了p53通路的大多数组，包括细胞周期（G1停滞）、细胞凋亡、DNA修复/损伤预防和p53负反馈。Ccnd1与Cdk6形成复合物以调节G1 / S转变，存在于p53信号通路和细胞周期的热图中（图1 a、b）。细胞周期蛋白G1（Ccng1）在DNA损伤后上调，并作为负反馈系统减弱p53的活性。基于这些结果，实验专注于Ccnd1、Cdk6和Ccng1，以使用实时定量聚合酶链反应（PCR）验证这些基因的mRNA表达（图1 c-e）。ICF 诱导 iPSCs 中的Ccnd1、Ccng1 和Cdk6 mRNA 表达（图1 c-e）。

图1 ICF调节iPSCs中的P53和细胞周期通路

使用KEGG数据库对用ICF和对照处理的iPSCs进行RNA测序分析。热图显示了P53信号通路和细胞周期通路（a、b）中差异表达的基因。 （c-e） 图表示 RNA 测序结果中选定基因（Ccnd1、Ccng1 和Cdk6）的 mRNA 表达。

为了进一步确认生物学功能，在无血清培养基中ICF处理24 小时后，使用流式细胞术进行细胞周期分析（条件1）。ICF处理导致SubG0群体减少，S期群体增加（图2 b、c）。ICF后，将细胞在正常生长培养基（血清存在下）中维持48小时并用于细胞周期分析（图2 a）（条件2）。与对照组相比，ICF刺激后G0/G1群体显著减少，而S和G2/M群体显著增加（图2 e、f）。在两种条件下，增殖指数均显著增加（图2 d、g）。

图2 ICF促进细胞周期进程

实验方案如（a）所示。条件的细胞周期分析：（1）iPSCs在无血清培养基（b，c）中用ICF处理24小时，（2）24小时后，将细胞在正常生长培养基中维持48小时（e、f）。条件 1 和 2 中的增殖指数如（d、g） 所示。

ICF处理的SubG0细胞数量的减少意味着细胞凋亡的减少。为了确认细胞凋亡的减少，用膜联蛋白V和碘化丙啶（PI）对细胞进行荧光染色，以鉴定早期和晚期细胞凋亡中的细胞。流式细胞术显示，ICF显著减弱了早期凋亡细胞的数量，但不影响晚期凋亡细胞的数量（图3 a、b）。

图3 ICF减少早期凋亡细胞的数量

iPSCs在无血清培养基中用ICF处理24小时。细胞用膜联蛋白V和碘化丙啶（PI）染色。早期和晚期凋亡细胞的百分比如（a、b）所示。

ICF通过TGF-β信号通路调节细胞周期相关基因的表达

众所周知，TGF-β信号通路在干细胞中受到机械应力的刺激。由于Tgfb1被鉴定为通过ICF刺激差异表达的细胞周期基因（图1 b），实验专注于TGF-β信号通路作为ICF调节细胞周期相关基因表达的可能机制。实时荧光定量PCR分析显示，ICF刺激在24 h后显著上调Tgfb1 mRNA表达（图4 a）。酶联免疫吸附测定（ELISA）和免疫荧光染色也证实了24小时时显著的Tgfb1蛋白表达（图4 b、c）。

为了研究TGF-β信号通路在ICF调节细胞周期中的参与，用4 μmol·L−1SB431542，TGF-β受体的抑制剂，在ICF应用前预处理iPSCs 30分钟（实验方案如图4 d所示）。SB431542减弱了ICF对Ccnd1和Cdk6 mRNA表达的影响（图4 e、f）。相比之下，SB431542预处理后Ccng1 mRNA表达水平无显著变化（图4 g）。与mRNA结果相对应，SB431542预处理降低了力诱导的Ccnd1蛋白表达（图4 h）。

图4 ICF通过TGF-β信号通路调节细胞周期相关基因表达

iPSCs在无血清培养基中用ICF处理。在2、8和24 h（a）使用实时荧光定量PCR研究了Tgfb1 mRNA表达，并在24 h通过ELISA（b）和免疫荧光染色（c）测定Tgfb1蛋白表达。在TGF-β抑制实验中，在暴露于压缩力之前用SB431542（4 μmol·L−1）处理细胞30分钟。实验方案如（d）所示。Ccnd1、Ccng1 和Cdk6的 mRNA 如 e-g 所示。使用蛋白质印迹分析（h）检查Ccnd1的蛋白表达。

总之，该研究表明，ICF促进iPSC增殖和细胞周期，抑制细胞凋亡。TGF-β信号通路可能参与 iPSCs 中 ICF 诱导的细胞周期进程。

参考文献：Manokawinchoke J, Limraksasin P, Okawa H, Pavasant P, Egusa H, Osathanon T. Intermittent compressive force induces cell cycling and reduces apoptosis in embryoid bodies of mouse induced pluripotent stem cells. Int J Oral Sci. 2022 Jan 4;14(1):1. doi: 10.1038/s41368-021-00151-3. PMID: 34980892; PMCID: PMC8724316.

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34980892/

小编旨在分享、学习、交流生物科学等领域的研究进展。如有侵权或引文不当请联系小编修正。

微信搜索公众号“Naturethink”，了解更多细胞体外仿生培养技术及应用！