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乳酸激活的GPR81可通过激活KLF2的表达来抑制振荡剪切应力诱导的内皮炎症

长期以来,内皮功能障碍和炎症一直被认为是动脉粥样硬化发病机制中的最早事件,因此是一个有价值的治疗靶点。振荡剪切应力(OSS)通过触发信号分子的释放来激活内皮细胞中的炎症反应,以响应流量感应受体的机械激活。暴露于高剪切应力和层流区域的内皮细胞通过释放无数动脉粥样硬化保护基因(包括Kruppel样因子2KLF2))而具有动脉粥样硬化保护能力。IL-8 和单核细胞趋化蛋白-1MCP-1)的表达驱动单核细胞募集到血管系统中的 OSS 区域,其中粘附分子包括血管粘附分子(VCAM-1 和内皮细胞选择素(E-selectin)导致单核细胞和白细胞滚动并粘附在内皮上。


KLF2是一种重要的锌指转录因子,对动脉粥样硬化产生具有保护作用。在层流剪切应力诱导下,KLF2下调VCAM-1E-选择素的表达,从而减弱单核细胞与内皮细胞的粘附。然而,KLF2在暴露于OSS的动脉分支和其他区域表达降低,这些区域长期以来一直被认为容易发生动脉粥样硬化病变。细胞外信号调节激酶5ERK5)是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族的成员,也密切参与调节内皮炎症和动脉粥样硬化的发生。


最近,G蛋白偶联受体(GPCRs)家族作为多种疾病的有价值的治疗靶点受到重视。在GPCR家族的大约800个成员中,GPR81,也称为羟基羧酸受体1HCAR1),是一种选择性乳酸敏感受体,已知在多种细胞类型中表达,包括脑细胞、脂肪细胞、各种癌细胞和视网膜等。GPR81已被证明在骨髓内皮细胞中高表达,据报道,GPR81介导的乳酸信号通路可调节炎症反应。


在华中阜外医院(河南省人民医院心脏中心)团队的一项研究中,探索了GPR81介导的乳酸信号通路在OSS诱导的内皮炎症中的潜在作用。


乳酸激活的GPR81可通过激活KLF2的表达来抑制振荡剪切应力诱导的内皮炎症


首先,实验进行了实时PCR和蛋白质印迹分析,以确定暴露于OSSHUVECsGPR81表达的影响。如图1 所示,持续暴露至 5 dyn/cm2 OSS以时间依赖性方式显著降低HUVECsGPR81的表达。在 24 小时时间点下,GPR81 的表达在 mRNA 和蛋白质水平上均降低了 50% 以上。


乳酸激活的GPR81可通过激活KLF2的表达来抑制振荡剪切应力诱导的内皮炎症

图1 暴露于振荡剪切应力(OSS)抑制了人脐静脉内皮细胞(HUVECs)中的GPR81。HUVECs用OSS处理(5 dyn/cm2) 8、16 和 24 小时。

(a)实时荧光定量PCR显示OSS在mRNA水平上降低了GPR81的表达。(b)蛋白质印迹显示OSS在蛋白质水平上降低了GPR81的表达。



众所周知,不同的流动模式在内皮细胞中引发不同的生物反应。经历OSS的内皮细胞进入促炎状态,而暴露于生理高剪切力(HSS)的内皮细胞则具有抗炎特性并表达动脉粥样硬化保护分子。通过将HUVECs暴露于OSSHSS15 dyn/cm2)中24小时,实验进一步研究了OSSHSSGPR81表达的调控是否不同。结果表明,HSSmRNA和蛋白质水平上显著增加了GPR81的表达,这与OSS的效果相反。这些数据表明,剪切应力具有直接增加或降低GPR81基础表达水平的能力。


氧化应激是内皮功能障碍过程中的关键因素。因此,研究了乳酸(GPR81特异性激动剂)对OSS诱导的氧化应激的影响。如图2所示,暴露于OSS使线粒体活性氧(ROS)的产生增加到大约四倍。然而,用乳酸处理将ROS的产生降低到仅约1.5倍基线水平,因此表明乳酸具有有效的抗氧化特性。


乳酸激活的GPR81可通过激活KLF2的表达来抑制振荡剪切应力诱导的内皮炎症


图2 用乳酸抑制振荡剪切应力(OSS)诱导的线粒体ROS生成。HUVECs在存在或不存在7.5、15 mM乳酸24小时的情况下用OSS处理(5 dyn/cm2)。线粒体ROS通过用MitoSOX红染色来测量。


接下来,确定了乳酸介导的激活参与OSS诱导的几种关键炎性细胞因子和趋化因子的表达。结果表明,OSSmRNA和蛋白质水平上触发了IL-6IL-8MCP-1表达的显著增加。然而,乳酸的存在导致这些分子的表达显著降低。同时,乳酸以剂量依赖性方式将OSS诱导的HMGB1表达从约5.2倍降低到仅1.8倍。


为了确定乳酸对OSS诱导的单核细胞与内皮细胞粘附的影响,实验研究了乳酸对VCAM-1E-选择素表达的影响。如图3所示,实时荧光定量PCR和蛋白质印迹分析的结果表明,OSS分别在mRNA水平,特别是在蛋白质水平上显著增加了VCAM-1E-selectin的表达。同时,两剂乳酸的加入极大地抑制了OSS诱导的这两种粘附分子的表达。为了确认乳酸的这种潜在的抗单核细胞粘附能力,进行了实验以确定暴露于OSS时附着在HUVECs上的人白血病细胞单核细胞U937的数量。结果表明,OSS将附着的U937细胞的数量增加到大约3.3倍,通过两剂乳酸以剂量依赖性方式减少到仅2.1倍和1.5倍。


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图3 用乳酸抑制振荡剪切应力(OSS)诱导的VCAM-1和E-选择素表达。

HUVECs在存在或不存在7.5、15mM乳酸24小时的情况下用OSS处理(5 dyn/cm2)。(a)通过实时PCR分析确定的VCAM-1和E-选择素的mRNA水平。(b) 通过蛋白质印迹分析确定的 VCAM-1 和 E-选择素的蛋白质水平。



最后,实验研究了KLF2ERK5通路在介导GPR81激活的这些保护作用中的参与。结果表明,暴露于OSS使动脉粥样硬化保护性转录因子KLF2的表达降低了约65%,通过使用乳酸激活GPR81KLF2mRNA和蛋白质水平上以剂量依赖性的方式恢复到接近基线水平。


为了确定ERK5通路在GPR81介导的KLF2表达恢复中的参与,首先测量了暴露于OSS和两剂乳酸时的磷酸化和总ERK5水平。如图4 a所示,OSS显著降低了p-ERK5的水平,而乳酸以剂量依赖性方式挽救了p-ERK5的水平。接下来,使用特异性ERK5抑制剂XMD8-92来确认GPR81KLF2的拯救是通过ERK5介导的。如图4 bc所示,抑制ERK5mRNA和蛋白质水平上消除了乳酸介导的对KLF2表达的恢复,从而表明乳酸介导的GPR81激活对OSS诱导的KLF2表达抑制的保护作用取决于ERK5通路。


乳酸激活的GPR81可通过激活KLF2的表达来抑制振荡剪切应力诱导的内皮炎症


图4 乳酸诱导的KLF2表达由ERK5介导。

(a)HUVECs在存在或不存在7.5、15mM乳酸24小时的情况下用OSS处理(5 dyn/cm2),测量p-ERK5和总ERK5。(b)HUVECs在存在或不存在15 mM乳酸24小时或特异性ERK5抑制剂XMD8-92(10 nM)的情况下用OSS处理(5 dyn/cm2),测量KLF2的mRNA水平。(c) HUVECs在存在或不存在15 mM乳酸24小时或特异性ERK5抑制剂XMD8-92(10 nM)的情况下用OSS处理(5 dyn/cm2),测量KLF2的蛋白质水平。



为了进一步证实GPR81参与介导乳酸对HUVECsOSS诱导的内皮功能障碍的保护作用,用siGPR81转染细胞。GPR81的成功敲低如图5 a。重要的是,发现敲低GPR81消除了乳酸对OSS诱导的VCAM-1E-选择素表达的抑制作用(图5 b)。GPR81的沉默也阻止了乳酸对OSS诱导的U937细胞附着于HUVECs的抑制作用(图5 c)。这些发现表明,乳酸对OSS诱导的HUVECs内皮功能障碍的抑制作用是由GPR81介导的。



乳酸激活的GPR81可通过激活KLF2的表达来抑制振荡剪切应力诱导的内皮炎症


图5 敲低GPR81消除了乳酸对内皮功能障碍的抑制作用。

(a)蛋白质印迹分析显示GPR81成功敲低。(b)通过蛋白质印迹分析测量VCAM-1和E-选择素的表达。(c)测定U937细胞与HUVEC的附着。



总之,该研究结果证明了GPR81作为有效的动脉粥样硬化保护受体的新作用。GPR81在暴露于OSS的血管动脉粥样硬化易发区域中的特异性激活可以通过抑制内皮炎症和氧化应激,抑制粘附分子的表达以及上调保护性KLF2转录因子的低表达来抑制动脉粥样硬化和动脉粥样硬化病变的发展。









参考文献:Sun Z, Han Y, Song S, Chen T, Han Y, Liu Y. Activation of GPR81 by lactate inhibits oscillatory shear stress-induced endothelial inflammation by activating the expression of KLF2. IUBMB Life. 2019 Dec;71(12):2010-2019. doi: 10.1002/iub.2151. Epub 2019 Aug 24. PMID: 31444899.

原文链接:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31444899/





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