剪切和动态压缩在体外调节人单核细胞的炎症表型

在骨折修复过程中会引发伤口愈合反应，骨髓刺激技术也会应用于软骨下骨穿透的软骨修复过程中。这涉及炎症细胞渗出或浸润到损伤部位，然后是凝血激活和纤维蛋白凝块形成，已知这可调节单核细胞趋化和增殖。

单核细胞和单核细胞衍生的巨噬细胞是关键的免疫效应细胞，在宿主防御中起着至关重要的作用，并有助于组织重塑和修复。巨噬细胞具有高度的可塑性，具有响应环境线索改变表型的潜力，并且可以根据促炎（M1）或抗炎（M2）亚群进行分类。浸润的单核细胞和巨噬细胞可能会影响肌肉骨骼组织修复过程的成功。

单核细胞和巨噬细胞存在于重塑组织的部位，这些组织受到机械力的影响，并且与修复反应有关。随着骨免疫学领域越来越重要，需要更详细地研究机械刺激对免疫细胞表型的影响。然而，巨噬细胞和单核细胞（它们的谱系前体）对骨骼组织固有的机械力的反应以及这种机械刺激对巨噬细胞表型的影响需要进一步阐明。

因此，瑞士AO达沃斯研究所一项研究的目的是研究机械剪切和压缩负荷对单核细胞活化和表型的影响。未刺激的、M1 或 M2 刺激的原代人单核细胞以及人单核细胞报告细胞系 THP1-Blue在体外暴露于剪切和压缩负荷的组合中，在机械刺激 3 天后评估炎症介质的基因表达水平和炎症蛋白分泌。文章名为《Shear and Dynamic Compression Modulates the Inflammatory Phenotype of Human Monocytes in vitro》。

为了研究机械负荷对巨噬细胞表型的影响，在负载前72小时，用 10 ng/ml IFN-γ （干扰素-γ，人单核THP1细胞的重要激活因子）和 100 ng/ml LPS（脂多糖）刺激CD14+ 单核细胞，诱导其分化为促炎/M1 表型，10 ng/ml IL-4 诱导其分化为抗炎/M2 表型或未刺激。在加载前 24 小时制备含有 THP1-Blue 单核细胞的琼脂糖凝胶。剪切（1 Hz，±25° ball rotation）和压缩（10%，1 Hz 压缩应变）每天1小时，连续3天。

多轴加载后差异激活的原代人单核细胞的促炎基因和蛋白质表达

与 IL-4 （白细胞介素-4）刺激的单核细胞相比，LPS和 IFN-γ 刺激的单核细胞在自由膨胀条件下具有显著更高的促炎基因IL8和CCL2的基因表达水平（分别增加 10.3 倍和 28.3 倍），证实了其促炎症表型（图1 A）。此外，与 LPS 和 IFN-γ 刺激的单核细胞相比，IL-4 刺激的单核细胞与显著更高的CCL18表达相关（增加 41.5 倍），证实了它们向 M2 样表型的极化。

与在自由膨胀条件下培养的单核细胞相比，在机械负荷 3 天后，未受刺激的原代人单核细胞显著上调促炎基因IL6（5.9 倍变化）和IL8（2.8 倍变化）的基因表达水平（图1 B）。此外，与自由膨胀对照相比，所有四名供体的抗炎巨噬细胞标志物IL10的表达均降低，负载后供体 1 和 3 中检测不到基因表达水平。炎症介质CCL18、TNF和CCL2的表达水平无显著差异。

虽然在机械负荷后观察到 LPS 和 IFN-γ 激活的单核细胞对炎症基因表达的相似趋势，但在供体之间观察到更大的变化，这些发现没有统计学意义（图1 C）。然而，CCL2的表达显著降低（降低 1.9 倍）。此外，在负载后，来自供体 1 和 3 的 LPS 和 IFN-γ 刺激的单核细胞中也检测不到 IL10的基因表达水平。与未刺激的单核细胞类似，IL-4 激活的细胞也显著增加了IL6（8.9 倍变化）并降低了IL10（3.1 倍）的表达（图1 D）。

图1 多轴加载后差异激活的原代人单核细胞的炎症基因表达。

（A）由实时 PCR 测量的在自由膨胀条件下培养 6 天的原代单核细胞的基因表达。

（B）多轴负载 3 天后，未受刺激的原代人单核细胞或 LPS 和 IFN-γ（C）或 IL-4（D）刺激的单核细胞基因表达水平。

与自由膨胀对照相比，未受刺激的单核细胞的机械负荷显著增加了促炎介质 TNF-α（17.1 ± 8.9 vs 8 ± 7.4 pg/ml）和 MIP-1α（636.8 ± 471.1 vs 124.1 ± 40.1 pg/ml）以及 IL-13（42.1 ± 19.8 vs 21.7 ± 13.6）的产生（图2）。

由负载的未刺激单核细胞产生的 IL-10、CCL18、IP-10、MCP-1、MDC 和 IL-1β 的蛋白质水平与自由膨胀对照组没有显著差异。与基因表达水平相似，响应于未刺激的单核细胞的负载，IL-6 产生增加的趋势。然而，观察到较大的供体变异，这一发现在静态上并不显著。除了 TNF-α、MIP-1α 和 IL-13 之外，机械刺激显著增加了LPS 和 IFN-γ 刺激的单核细胞的 MDC 水平（图2）。与基因表达数据相似，IL-4 激活的单核细胞响应机械负荷 显著增加促炎因子 IL-6、IL-8、TNF-α、MIP-1α、IP-10、IL-13、IL -1β 和 IL-10的表达，并降低 CCL18 和 MDC 的表达（图2）。

图2 多轴加载后原代人单核细胞产生的炎症介质，通过 ELISA 和多重测定进行量化。

IL-6：白细胞介素-6；IL-10：白细胞介素-10；CCL18：趋化因子（CC 基序）配体18；TNF-α：肿瘤坏死因子-α；MIP-1α：巨噬细胞炎症蛋白-1α；IP-10：CXC 基序趋化因子 10；MCP-1：单核细胞趋化蛋白-1；IL-13：白细胞介素-13；MDC：巨噬细胞衍生趋化因子；IL-1β：白细胞介素-1β；IL-8：白细胞介素-8。

THP1-Blue 单核细胞在机械剪切力或压缩力后的炎症基因和蛋白质表达

为了评估机械剪切力或压缩力对人类单核细胞炎症基因和蛋白质表达的差异调节的潜力，将未受刺激的 THP1-Blue 单核细胞置于多轴负载条件下，或单独进行机械剪切或压缩。

THP1-Blue 单核细胞在机械负载 3 天后，与压缩和剪切的组合以及的单独剪切相比，单独压缩条件显著上调促炎标志物NOS2和IL12B的基因表达水平（图3）。IL6、IL-8、TNF- α、PTGS2、IL-10、CCL2和CCL18的基因表达水平在加载条件之间或与自由膨胀对照组相比没有显著差异。

然而，与对照相比，在从经受压缩和剪切组合以及单独压缩和剪切3 天的凝胶中收获的细胞培养基中检测到显著增加的 TNF-α、IL-10、IL-8、IL-13 和 MDC 水平（图4 A）。此外，与所有其他培养条件相比，单独施加压缩载荷显著上调了单核细胞产生的 IL-1β，而单独施加剪切增加了 MCP-1 的释放。

与自由膨胀培养物相比，IL-6 和 IP-10 的水平在响应任何加载条件时没有显著差异。除了调节炎性细胞因子的产生外，应用压缩和剪切或单独剪切可诱导 THP1-Blue 单核细胞释放分泌的碱性磷酸酶，这表明 NF-κB 和 AP-1 转录因子被激活（图4 B）。

图3 THP1-Blue 单核细胞在单独响应多轴载荷、剪切或压缩时表达的炎症基因水平。通过实时 PCR 测量，THP1-Blue 单核细胞在单独多轴加载、剪切或压缩 3 天后的基因表达。

图4 剪切和压缩差异调节 THP1-Blue 单核细胞的炎症介质表达。

（A）通过 ELISA 和多重测定法测量的多轴加载、剪切或压缩 3 天后 THP1-Blue 单核细胞产生的炎症介质水平。

（B）通过分光光度法测量，在加载 3 天后在细胞培养上清液中检测到 SEAP 水平。

总之，该研究的结果表明，人类单核细胞对机械刺激有反应，并观察到剪切力和压缩负荷对促炎介质产生的调节作用。深入了解骨骼组织相关机械负荷对单核细胞行为的影响及其对局部细胞反应和组织修复过程的后续影响，可能会发现新的策略，以最大化炎症介导的修复机制。此外，研究结果可能为开发新的康复医学策略以改善骨骼组织修复的治疗结果提供见解。

参考文献：Fahy N, Menzel U, Alini M, Stoddart MJ. Shear and Dynamic Compression Modulates the Inflammatory Phenotype of Human Monocytes in vitro. Front Immunol. 2019 Mar 5;10:383. doi: 10.3389/fimmu.2019.00383. PMID: 30891042; PMCID: PMC6411641.

原文链接：https://pubmed-ncbi-nlm-nih-gov.proxy.library.carleton.ca/30891042/

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