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Kindlin-2 促进与 BMSCs 共培养的软骨细胞中的软骨形成并改善 IL-1beta 诱导的炎症

受创伤或炎症因子损伤的关节软骨往往难以有效修复,最终发展为骨关节炎(OA)。OA 的发病率逐年增加,已成为威胁人类健康的严重疾病。然而由于我们对骨关节炎发病机制的了解有限,目前仍然没有治愈或有效的治疗方法。通过构建软骨组织工程学方法修复关节软骨缺损是近年来研究的热点,其中如何进一步优化种子细胞的来源和质量仍然是软骨组织工程的重点和难点之一。


软骨细胞和骨髓间充质干细胞(BMSCs)是目前常用的种子细胞。两者在软骨组织工程的构建上都有缺陷。原代软骨细胞来源相对有限,在体外传代数次后往往会失去其特殊表型。为了维持BMSCs 向软骨细胞分化,必须提供外源性细胞因子。研究人员尝试将这两种细胞系共培养,结果表明,共培养可以增加软骨细胞外基质(ECM)成分的合成,例如 II 型胶原蛋白(Col2)和聚集蛋白聚糖(Aggrecan)。


Kindlin-2 属于保守的细胞质蛋白家族。Kindlin-2 通过与整合素相互作用促进细胞分化、存活和迁移,并参与介导整合素对细胞增殖和细胞间通讯的调节。Kindlin-2 表达不足会导致软骨形成异常,影响软骨细胞的存活。Kindlin-2 在小鼠体内的整体失活导致 E7.5 的早期胚胎致死率。


为了探索 Kindlin-2 在直接接触共培养系统中促进特异性 ECM 合成的作用,南京医科大学第一附属医院骨外科的课题组曾进行过一项研究,在软骨细胞中特异性敲低和过表达 Kindlin-2,构建了软骨细胞和 BMSCs 的直接接触共培养系统。



Kindlin-2 促进与 BMSCs 共培养的软骨细胞中的软骨形成并改善 IL-1beta 诱导的炎症




Kindlin-2 促进直接接触共培养系统中的软骨形成


BMSCs 可以为直接接触共培养系统中的软骨细胞提供营养支持。为了探讨直接接触共培养系统中软骨形成的关键调控因子(图1 a),实验对系统中与或不与 BMSCs 共培养的软骨细胞进行了3次生物复制,通过高通量 RNA 测序(RNA- seq)进行转录组分析(图1 b)。结果表明,Kindlin-2 的表达水平上调了 5.18 倍。与其对照组相比,共培养的软骨细胞表现出增加的软骨发育和细胞外基质组织(图1 c)。RT-qPCR 的结果还证实,与 BMSCs 共培养显著上调了软骨细胞中 Kindlin-2 mRNA 的表达水平(图1 d)。


在体外探讨了 Kindlin-2 是否参与了 BMSCs 对软骨细胞的调控。如图1 ef,Kindlin-2 被敲低并在软骨细胞上过表达,经 qPCR 和蛋白质印迹证实。实验选择了 sh-2 sh-3 组进行进一步调查。正如预期的那样,软骨细胞特异性生物标志物(Col2Sox9 Aggrecan)的 mRNA 表达水平表明,在直接接触共培养系统中,Kindlin-2 的敲低减弱了 BMSCs 对软骨细胞的调节(图1 g)。这些结果在软骨细胞与 BMSCs 微量共培养后通过阿尔新蓝和番红固绿染色和定量分析得到证实(图1 h–j)。


过表达 Kindlin-2 的软骨细胞中 Col2Sox9 Aggrecan mRNA 表达值表明,在直接接触共培养系统中,过表达 Kindlin-2 的软骨细胞与 BMSCs 共培养可显著改善 BMSCs 对软骨细胞的调节,促进特异性 ECM 合成(图1 k)。同样,过表达 Kindlin-2 的软骨细胞与 BMSCs 共培养 7 天,然后用阿尔新蓝和番红固绿染色(图1 l–n)。


总的来说,这些结果表明 Kindlin-2 可以促进直接接触共培养系统中的软骨形成。



Kindlin-2 促进与 BMSCs 共培养的软骨细胞中的软骨形成并改善 IL-1beta 诱导的炎症


图1 Kindlin-2在直接接触共培养系统中促进软骨形成。



直接接触共培养系统中软骨细胞 Kindlin-2 对 PI3K/AKT/mTOR 信号通路的潜在调节作用


对直接接触共培养系统中与 BMSCs 共培养的软骨细胞与单独培养的软骨细胞之间的差异表达基因进行 KEGG 通路分析,以进一步确定 Kindlin-2 调节软骨细胞 ECM 合成和分泌的分子机制。与对照软骨细胞相比,与 BMSCs 共培养的软骨细胞中 PI3K/AKT 信号通路显著激活。结果显示,与 PI3K/AKT 信号通路相关的基因在共培养组中显著增强,提示 Kindlin-2 PI3K/AKT 信号通路中具有潜在的调节作用。


软骨细胞是对软骨健康和功能起主要影响,PI3K/AKT 信号通路是软骨细胞存活和凋亡的重要调节因子。 PI3K/AKT/mTOR 信号通路被激活, Kindlin-2 的敲低减少, Kindlin-2 的过表达增加了直接接触共培养系统中磷酸化的 PI3KAKT mTOR 的水平。在没有共培养的情况下,磷酸化的 PI3KAKT mTOR 水平都没有改变


为了进一步证实 PI3K/AKT/mTOR 信号通路参与 Kindlin-2 介导的软骨细胞 ECM 分泌,实验使用了靶向 PI3K 的小分子抑制剂(LY294002)。BMSCs 共培养的软骨细胞中,LY294002 抑制 PI3K/AKT/mTOR 信号通路。用 LY294002 处理后 Col2 Sox9 的表达水平降。当在共培养前用 LY294002 处理过表达 Kindlin-2 的软骨细胞时,观察到了类似的结果。这些结果与 RNA 测序数据一致,表明 Kindlin-2 可能是直接接触共培养系统中 PI3K/AKT 信号通路的主要调节因子。




软骨细胞中 Kindlin-2 介导的 PI3K/AKT 信号通路对软骨形成至关重要


软骨细胞和骨髓间充质干细胞共培养。阿尔新蓝和番红固绿染色和随后的定量分析表明,在直接接触共培养系统中,小分子抑制剂 LY294002 可以显著抑制软骨细胞 ECM 的合成和分泌。Col2Sox9 Aggrecan mRNA 表达水平也证实了这些结果


此外,对使用 LY294002 后与 BMSCs 共培养的 Kindlin-2 过表达软骨细胞进行阿尔新蓝、番红固绿染色及 mRNA 表达水平的分析证实,Kindlin-2 在软骨细胞中的 ECM 分泌促进作用受到 PI3K/AKT 的调节


软骨细胞与 BMSCs 直接接触共培养, Kindlin-2 表达上调。随后,PI3K/AKT 信号通路的激活被证明可以增加 Sox9 Col2 的表达,从而促进软骨细胞 ECM 的合成和分泌。


总体而言,这研究结果为直接接触共培养系统中软骨细胞和 BMSCs 之间的相互作用提供了新的机制基础。




Kindlin-2 介导的 PI3K/AKT 通路保护软骨细胞免受 IL-1beta 诱导的炎症


在与 OA 相关的促炎细胞因子中,IL-1beta 被认为是主要参与者之一。IL-1beta 似乎与软骨破坏有关。体外模拟 IL-1beta 在骨关节炎过程中对软骨细胞的促炎和分解代谢作用,软骨细胞用 IL-1beta 处理,有或没有直接接触共培养 48h。结果表明,与对照软骨细胞相比,IL-1beta 处理 48h 后,凋亡软骨细胞(早期和晚期凋亡)的百分比显著降低。Kindlin-2 的敲低通过 PI3K/AKT 通路减弱了直接接触共培养对软骨细胞的保护作用,这通过添加小分子抑制剂 LY294002 得到进一步证实。当在直接接触共培养系统中将过表达 Kindlin-2 的软骨细胞与 BMSCs 共培养并使用 LY294002 时,观察到了类似的结果


线粒体膜电位对于维持线粒体氧化磷酸化和 ATP 产生至关重要。线粒体膜电位的降低是细胞凋亡的标志性事件之一。如图4 e–h,软骨细胞用 IL-1beta 处理 48h 后线粒体膜电位显著降低。直接接触共培养恢复了线粒体膜电位,而小分子抑制剂 LY294002 消除了这种作用。Kindlin-2 的敲低降低线粒体膜电位,而 Kindlin-2 的过表达增强了线粒体膜电位的恢复。


有研究表明 ROS OA 发展的主要致病因素。由 ROS 引发的氧化应激能够氧化并随后破坏软骨稳态并通过诱导细胞死亡来促进分解代谢。使用 DCFDA 荧光探针发现,IL-1beta 显著增加了细胞内 ROS 的产生,而与 BMSCs 共培养的软骨细胞减少了 ROS 的产生。软骨细胞在直接接触共培养系统中以 kindlin -2 介导的 PI3K/AKT 方式调节 ROS 的生成。



总之,该研究为直接接触共培养系统中与 BMSCs 共培养的软骨细胞中 Kindlin-2 的调节作用和具体机制提供了新的见解。Kindlin-2 对于在软骨形成过程中调节软骨细胞功能和 ECM 分泌至关重要。此外,研究表明,Kindlin-2 介导的 PI3K/AKT 信号通路控制细胞凋亡、线粒体膜电位和响应 IL-1beta 的 ROS 产生。这项工作可能为用过表达 Kindlin-2 的软骨细胞代替传统的种子细胞构建高质量的组织工程软骨提供了可能性。




参考文献:Chen Z, Shen K, Zheng Z, Zhou J, Zhao S, Song H, Liu J, Zhao X, Liu F, Zuo Q. Kindlin-2 Promotes Chondrogenesis and Ameliorates IL-1beta-Induced Inflammation in Chondrocytes Cocultured with BMSCs in the Direct Contact Coculture System. Oxid Med Cell Longev. 2022 Apr 12;2022:3156245. doi: 10.1155/2022/3156245. PMID: 35450413; PMCID: PMC9018182.

原文链接:https://pubmed-ncbi-nlm-nih-gov.proxy.library.carleton.ca/35450413/

图片来源:所有图片均来源于参考文献


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