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表皮生长因子受体的药理抑制通过调节 VSMCs 表型来减弱 IA 的形成

颅内动脉瘤(IA)是蛛网膜下腔出血的主要原因,预示着严重的发病率和高死亡率。IA 的发生是由病理过程引起的,例如炎症反应和异常的血管重塑。先前的研究表明,异常血管重塑是导致 IA 发病机制的最重要因素,是由管腔力引起的,包括剪切应力、高血流量和湍流。



在动脉瘤形成的早期阶段,炎症因子的升高主要集中在血管平滑肌细胞(VSMCs)中。对平滑肌细胞 (SMCs) 的体外研究发现,高壁面切应力 (WSS) 可诱导炎症介质(称为基质金属蛋白酶 (MMP))的分泌。表型转化发生在 VSMCs 中,是指 VSMCs 从收缩表型转变为促炎表型,其特征是 α-SMA 和 SM22α 表达降低,MMPs 表达增加。为了充分理解这个过程,有必要明确 VSMC 表型转化背后的机制。

表皮生长因子受体(EGFR)信号转导功能广泛,与多种血管疾病密切相关,EGFR 家族的所有成员和大多数 EGFR 配体都在 VSMCs 中表达。表皮生长因子受体激活诱导的 VSMC 表型调节由下游效应物细胞外信号调节激酶 1/2 (ERK1/2) 和 p38 丝裂原活化蛋白激酶 (p38 MAPK) 介导的。厄洛替尼是 EGFR 的选择性抑制剂,可与 EGFR 的 ATP 结合位点进行可逆结合,阻断其同源二聚体的反式磷酸化。尽管最近有报道称厄洛替尼可预防腹主动脉瘤,但 EGFR 在 IA 形成中的作用仍不清楚。

基于此,华中科技大学生命科学与技术学院生物医学工程系、上海第二军医大学附属长海医院神经外科、战略支援部队特色医学中心神经内科的联合研究团队进行了研究,确定了人 IA 样本中磷酸化 EGFR 的表达水平,并使用厄洛替尼来验证 EGFR 在 IA 模型模型中的生物学作用。此外探索了 WSS 刺激的 VSMCs 中 EGFR 和下游信号通路的激活。


首先,实验数据表明 p-EGFR 表达在人 IA 样本中升高,微阵列分析显示 EGFR 配体的 mRNA 表达在兔 IA 模型中升高。在大鼠 IA 模型中使用厄洛替尼对 EGFR 的药理学阻断表明,EGFR 激活对 VSMC 表型转化和促炎细胞因子的产生是必需的。通过 WSS 诱导的共培养 VSMC 表型转化来刺激 ECs,并且 EGFR 激活介导了 VSMCs 中 TNF-α 诱导的表型转化。



这些数据表明,EGFR 是调节 IA 中 VSMC 表型转化的关键介质。这项研究首次表明 EGFR 在 IA 的发展中很重要,并且它可以被 EGFR 特异性抑制剂抑制。该研究结果为预防和治疗 IA 的药物研发提供了进一步的信息。

为了探索动物手术后 EGFR 的激活是短暂的还是持续的,实验确定了不同时间间隔 p-EGFR 的表达。如图1 所示 ,p-EGFR 在第 2 天被诱导并随着时间的推移而增加,这表明异常的血流动力学可以为 EGFR 激活提供持续的刺激,并诱导 VSMC 从收缩表型转变为促炎表型。

研究人员进一步研究以确定参与 IA 发展的关键 EGFR 配体。在此,首次证明了 WSS 间接刺激了大鼠大脑 VSMCs 中的 EGFR 激活和下游信号传导,并且在大鼠 IA 模型中发现 p38 MAPK 和 ERK1/2 的磷酸化,p38 MAPK 的激活被厄洛替尼抑制。


表皮生长因子受体的药理抑制通过调节 VSMCs 表型来减弱 IA 的形成

图1 大鼠颅内动脉瘤 (IA) 模型 Willis 环脑血管中的 EGFR 磷酸化。


接下来,实验发现 VSMCs 可以从具有血管壁重塑的收缩表型转变为促炎表型,但是这种表型转化是否调控 VSMC 增殖仍不清楚。后续研究发现厄洛替尼在动物实验中可以显著减少血管壁的增厚,减弱内部弹力层的破坏,并使动脉瘤壁的变薄——所有这些都可能导致 IA 形成的发生率降低。这表明异常血流动力学持续诱导 EGFR 磷酸化。



为了重现颅内动脉血管壁的结构,建立了从大鼠 ACAs 中提取的 ECs 和 VSMCs 的体外共培养模型,以验证血流动力学应激诱导的 EGFR 激活。如图2 A所示,VSMCs 和 ECs 放置流动室之前,在一个薄膜的两侧共培养,VSMCs 在静止培养基中培养,而 ECs 在流动培养基中以不同强度(0、4、12、30、36 dyn/cm2)和刺激时间(24、48、72h)受到 WSS 刺激。

为了研究共培养模型中 WSS 刺激的适当持续时间和强度,进行了下一步的实验。实验结束时,收集 VSMCs 并通过免疫印迹评估 EGFR、p-EGFR (Y1068)、α-SMA、MMP-2 和 MMP-9 的表达。

结果发现,p-EGFR 的表达水平随着 WSS 强度和刺激持续时间的增加而增加,并在 WSS 强度为 36 dyn/cm2、刺激时间为 24h 时达到峰值;然而,总 EGFR 的表达水平保持一致。α-SMA 的表达水平随着 WSS 强度的增加和刺激持续时间的延长而相应减少,而 MMP-2 和 MMP-9 的表达水平增加。这些结果表明,由于 WSS 强度和刺激的持续时间,VSMCs 从收缩表型被调节为促炎表型。

为了验证厄洛替尼对 VSMCs 表型转化的抑制作用,在培养基中使用不同浓度的厄洛替尼(1、5、25、125 nM),在 36 dyn/cm2 的 WSS 下持续 24 小时。如图2 B、C 所示 ,p-EGFR 的表达与厄洛替尼浓度的增加呈负相关,而总 EGFR 的表达保持不变。此外,如图2 F-H 所示, 随着 p-EGFR 表达的降低,α-SMA 增加,MMPs 减少。重要的是,25 nM 浓度的厄洛替尼完全逆转了由高 WSS (36 dyn/cm2 )诱导的 VSMC 表型转化。这些数据表明,体外 WSS 诱导的 VSMC 表型转化需要 EGFR 激活。


表皮生长因子受体的药理抑制通过调节 VSMCs 表型来减弱 IA 的形成

图2 在体外共培养模型中,厄洛替尼降低了血流动力学诱导的血管平滑肌细胞 (VSMC) 的表型转化。


炎症是 IA 发生和维持的重要机制。在炎症细胞浸润之前的 IA 启动过程中,发现了 VSMC 表型向炎症状态的调节。据此,研究人员观察到大鼠 IA 模型和 WSS 刺激的共培养模型的 VSMCs 中 MMPs 和 TNF-α 的表达增加。EGFR 抑制减弱了 MMPs 的表达,表明 EGFR 调节 VSMCs 中细胞因子的产生。此外,鉴于在 IA 损伤中已观察到巨噬细胞,EGFR 可能会影响其他细胞(如巨噬细胞)中细胞因子的产生。


总之,该研究表明,异常血流动力学在 IA 形成的早期阶段激活 VSMC 中的 EGFR,并刺激 VSMC 表型转化导致 IA 的发生。然而,厄洛替尼对 EGFR 的药理学阻断抑制了 IA 的形成和 VSMCs 表型调节。进一步的研究表明,EGFR 被非 EGFR 配体如 TNF-α 反式激活。因此,这项研究揭示了 EGFR 抑制剂在治疗 IA 中的潜在用途,并为其预防提供了新的途径。


参考文献:Luo Y, Tang H, Zhang Z, Zhao R, Wang C, Hou W, Huang Q, Liu J. Pharmacological inhibition of epidermal growth factor receptor attenuates intracranial aneurysm formation by modulating the phenotype of vascular smooth muscle cells. CNS Neurosci Ther. 2021 Nov 2. doi: 10.1111/cns.13735. Epub ahead of print. PMID: 34729926.
原文链接:https://pubmed-ncbi-nlm-nih-gov.proxy.library.carleton.ca/34729926/


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