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iNOS 的上调保护大鼠主动脉平滑肌细胞中循环机械拉伸诱导的细胞死亡

主动脉夹层动脉瘤是指主动脉内膜及中层损伤后,血液经撕裂的内膜口进入主动脉壁中层,产生血管壁剥离,形成假性腔道。随血流冲击,血管壁剥离逐渐延伸呈瘤样扩张,侵及主动脉内环,导致瓣环变形扩张,形成主动脉瓣关闭不全口。由于血流是脉动的,高血压期间发生的血流动力学负荷使中层的血管平滑肌细胞 (VSMCs) 受到循环机械拉伸 (CMS) 的影响,引发 VSMC 增殖、细胞死亡、表型转换和迁移,从而导致血管重塑。


许多病理生理学研究表明,主动脉夹层开始后 VSMC 的数量显著减少,这表明在血压急剧升高和随后的主动脉疾病之前和期间发生了 VSMC 死亡。为了阐明由高血压相关的机械拉伸引起的 VSMC 死亡的可能原因,已经做出了大量的努力。然而,细胞的机械力学敏感性机制尚未完全清楚,目前尚不了解哪些生物力学过程会导致 VSMC 死亡。

iNOS 在病理状态下可能是一种有害酶,被认为是导致心血管系统疾病(如动脉粥样硬化和高血压)的主要因素。然而,一些研究人员提出,iNOS 可能通过抑制 VSMCs 的增殖和迁移以及刺激内皮细胞生长来保护 VSMCs。有研究表明,iNOS 在小鼠缺血预处理过程中具有心脏保护作用,表明 iNOS 对血管重塑的作用存在争议。

来自日本奈良县立医科大学药理学系、和歌山县立医科大学医学病理学系的研究团队之前对此进行过研究,报道了 CMS 在大鼠主动脉平滑肌细胞 (RASMCs) 中模拟血压突然升高导致 JNK 和 p38 依赖性细胞死亡。在本研究中,该团队探索了 iNOS 如何影响 CMS 诱导的 RASMC 死亡,并讨论了 iNOS 作用的可能机制。


循环机械拉伸增强 iNOS 表达


研究人员使用实时 RT-PCR 来评估一些可能参与 RASMC 死亡和动脉瘤的基因的表达,以确认从 cDNA 微阵列和转录组分析中获得的结果。在循环拉伸的 RASMCs 中,iNOS、NR4A1、SERPINE1、MMP9 和 MMP13 的转录本表达存在差异。iNOS、NR4A1 和 SERPINE1表达水平在接受 CMS 的 RASMCs 中显著增加,而 MMP9 和 MMP13 的表达水平相对于对照组和 CMS 处理的 RASMCs 没有显著变化。所以,在接下来的研究中,专注于 iNOS 在 CMS 诱导的细胞死亡中的作用,而不考虑 NR4A1 和 SERPINE1 的影响。


CMS 以 p38 依赖的方式改变 iNOS 的表达和 NO 的产生


实验接下来利用 JNK 和 p38 抑制剂(分别为 SP600125 和 SB203580)评估了 iNOS 的 mRNA。值得注意的是,与不存在 p38 抑制剂的 CMS 细胞相比,p38 抑制剂 SB203580 导致 iNOS 转录水平降低约 40% ,表明 iNOS 表达受 p38 的转录调控。相反,SP600125 不影响 iNOS 表达。

为了研究 CMS 诱导的 iNOS 表达是否受 NF-κB 通路的调控,在 CMS 之前用 IKK(NF-κB 的必需调节剂)抑制剂(BAY11-7082)预处理 RASMCs。结果发现 BAY11-7082 不影响 iNOS 的表达。结果表明,CMS 对 iNOS 基因表达的诱导可能与 p38 相关并受其控制。

接下来发现,在 CMS 处理的 RASMCs 中,p38 和 iNOS 抑制剂(分别为 SB203580 和 1400 W)对 NO 产生的抑制程度相同,表明 CMS 诱导的 iNOS 表达和 NO 产生均依赖于 p38。

iNOS 抑制剂使 CMS 诱导的 RASMC 死亡增加、NO 供体减少


接下来实验研究了 iNOS 和 NO 对 CMS 诱导的 RASMCs 细胞死亡的影响。与单独用 CMS 处理的 RASMCs 相比,用 iNOS 抑制剂 (50 nM) 预处理的 RASMCs 的存活率降低了30%(图3 A)。这些数据得到了 LDH 测定的证实。

相比之下,长效 NO 供体 DETA-NONOate (2 µM) 将细胞活力提高了 25%,并降低 RASMCs 的细胞死亡率 。由于 DETA-NONOate 在 37°C 下的半衰期约为 20 小时,DETA-NONOate 稳定释放少量 NO 可防止 CMS 诱导的 RASMC 死亡。这些结果表明 iNOS 的表达和 NO 的产生可以以浓度依赖性方式抑制 CMS 诱导的 RASMCs 死亡。

为了确定高血压是否可以在体内诱导 iNOS 表达,研究人员使用腹主动脉缩窄 (AAC) 小鼠模型评估了 VSMCs 中 iNOS 的表达,结果表明 VSMCs 中 iNOS 的表达可能在高血压的早期阶段被诱导。


为了明确 STAT1 是否参与调控 CMS 诱导的 iNOS 表达,实验用 STAT1 选择性抑制剂 nifuroxazide 对 RASMCs 进行预处理。这种预处理显著降低了 CMS 作用下 RASMCs iNOS 蛋白表达,证明激活 STAT1 可能是诱导 iNOS 不可或缺的因素。


为了阐明 STAT1 和 p38 如何参与 RASMCs 中 CMS 调节的 iNOS-NO 信号传导的机制,实验进行了蛋白质印迹分析以评估它们的潜在关联。免疫印迹证实 STAT1 在 CMS 作用下被磷酸化。有趣的是,p38 抑制剂 SB203580 不影响 STAT1 的磷酸化,并且 STAT1 抑制剂 nifuroxazide 没有改变 p38 的磷酸化。这些数据表明 STAT1 和 p38 可能独立调控 iNOS-NO 信号。



基于该研究结果,该团队认为 iNOS 的诱导可以在血压骤升的早期阶段对 VSMCs 的死亡提供保护作用,这可能会抑制血管重塑。然而,与 iNOS 活性相关的高 NO 水平可能对心血管系统产生不利影响,导致高血压。这些发现为早期预防和治疗由急性高血压引起的主动脉夹层和动脉瘤提供了一种新方法。



参考文献:Zhao J, Nakahira K, Kimura A, Kyotani Y, Yoshizumi M. Upregulation of iNOS Protects Cyclic Mechanical Stretch-Induced Cell Death in Rat Aorta Smooth Muscle Cells. Int J Mol Sci. 2020 Nov 17;21(22):8660. doi: 10.3390/ijms21228660. PMID: 33212839; PMCID: PMC7698365.
原文链接:https://pubmed-ncbi-nlm-nih-gov.proxy.library.carleton.ca/33212839/

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