高血压是心血管疾病 (CVD) 的主要危险因素,可导致血管结构和功能异常。高血压通常伴随着血管壁机械拉伸的增加。因此,过度的机械拉伸会影响血管细胞,例如内皮细胞 (ECs)、血管平滑肌细胞 (VSMCs) 和外膜成纤维细胞,并导致这些细胞功能障碍 ,从而引起血管结构和功能异常。
虽然牵张力可以影响所有血管细胞,但位于血管壁中膜的 VSMCs 是主要的靶细胞。在生理条件下,VSMCs 很少发生增殖和迁移,通常表现出收缩表型。然而,在异常的机械牵张力下,VSMCs 发生表型转变,表现为增殖、迁移和细胞外基质合成增加,从而导致动脉壁增厚和变硬。肾素血管紧缩素系统(RAS)与心血管疾病密切相关。ACE2 是 ACE 的同源物,但在底物特异性方面与 ACE 不同。ACE2 对动脉粥样硬化的保护作用已在各种研究中得到证实。这种酶在人和动物,包括大鼠和小鼠的正常和病变血管中都有表达。它在不同的细胞类型中含量丰富,例如 ECs、VSMCs 和巨噬细胞。人们普遍认为 RAS 系统与机械刺激密切相关。机械拉伸通过上调大鼠 SMCs 中的 AT1 受体来促进血管损伤。也有研究证实,内皮细胞暴露于剪切应力下可通过 p53 和 miR-143/145 转录后调控降低 ACE 的表达。来自中国医学科学院、山东大学齐鲁医院等机构的专家团队先前证明, ACE 可以介导 SMCs 的机械拉伸诱导的表型调控。然而,血管细胞中 ACE2 表达的调控机制,尤其是机械刺激的调控机制尚不清楚。有一项研究发现 ACE2 在低剪切应力诱发的颈动脉斑块中含量丰富,因此研究人员推测 ACE2 也具有机械反应性,可能参与了机械拉伸诱导的血管重构。基于此,该团队进一步研究,于 Frontiers in Physiology 上联合发表了了题为《Mechanical Stretch Induces Smooth Muscle Cell Dysfunction by Regulating ACE2 via P38/ATF3 and Post-transcriptional Regulation by miR-421》的研究成果。在该研究中,建立了腹主动脉缩窄模型,以研究 ACE2 在体内血管建模中的作用。在体外研究中,VSMCs 在指定的时间内进行机械拉伸。该研究的目的是探索 ACE2 在机械拉伸下的 VSMCs 的功能中所起的作用,以及这一过程的可能机制。
实验结果
大鼠体内腹主动脉缩窄影响 ACE2 和 ACE 的表达
在大鼠中进行腹主动脉缩窄模型以诱导压力超负荷,结果表明,ACE2 和 ACE 都对血压引起的机械拉伸有响应。然后,实验收集了合并或不合并高血压的结直肠癌患者的癌旁组织, 其中 6 例有高血压病史。结果显示,在高血压患者中,包括不同大小的动脉,平滑肌细胞中 ACE2 的表达明显减少。机械拉伸在体外调节血管平滑肌细胞中 ACE2/Ang-(1-7) 和 ACE/AngII 的表达
由于 VSMCs 是机械拉伸升高的主要靶细胞,该研究重点关注 VSMCs 的功能。在这里,使用机械拉伸加载系统,结果发现,在指定时间内进行机械拉伸的 VSMCs 在 mRNA 和蛋白质水平上都显示出 ACE2 的表达降低,从 6 小时开始显著降低(P < 0.05),而 ACE 的表达增加( P < 0.05)。ACE2 酶活性也在拉伸下下降(P < 0.05)。ACE2 的保护作用与其降解血管收缩剂 (AngII) 和产生血管舒张剂 [Ang-(1-7)] 的能力有关,因此实验还评估了细胞质蛋白中 Ang-(l-7) 和 AngII 的水平。Ang-(l-7) 水平下降,而 AngII 水平在拉伸下随时间增加(P < 0.05)。
ACE2 对机械拉伸诱导的 VSMC 增殖、迁移、凋亡和胶原代谢的影响
机械牵张可能调节 VSMCs 增殖、迁移和表型转化等功能,与静态对照相比,18% 的机械拉伸12h 显著促进了 VSMCs 的增殖,而 ACE2 的过表达部分挽救了因拉伸产生的增殖(P < 0.05)。细胞划痕实验表明,拉伸条件下,VSMCs 的迁移距离明显受到刺激,而机械拉伸对迁移的促进作用被 ACE2 过表达部分抵消(P < 0.01)。此外,ACE2 的过表达逆转了机械拉伸诱导的细胞凋亡和胶原合成(P < 0.05)。总之,结果表明 ACE2 参与了机械牵张诱导的 VSMC 功能障碍
p38 MAPK/ATF3 通路参与机械拉伸下 ACE2 的表达
最近的一项研究表明,Ang II 通过 AT1-ERK/p38 MAP 激酶通路下调 ACE2。该团队发现机械拉伸诱导了 p38 MAPK、JNK 和 ERK1/2 的磷酸化(P < 0.05)。为了验证这些结果,VSMCs 用 p38 MAPK 抑制剂 SB203580、JNK 抑制剂 SP600125 或 ERK1/2 抑制剂 PD98059 预处理 1 小时,然后细胞进行 18% 的拉伸持续 12 小时。结果表明,SB203580 能显著减弱牵张诱导的 ACE2 下调(P < 0.05)。当暴露于 18% 的机械拉伸时,ATF3 的表达增加,SB203580 阻断了该诱导(P < 0.05)。这一结果与之前认为 ATF3 的激活是通过 p38 MAPK 通路的研究相一致。
然后,使用 ATF3 siRNA 转染 VSMCs,发现 ATF3 的敲低逆转了机械拉伸导致的 ACE2 水平下调(P < 0.05)。免疫荧光显示,在 18% 的拉伸下,细胞核区域的 ATF3 水平升高,这表明机械拉伸通过促进 ATF3 进入细胞核来调节 ACE2 的表达。因此,有充分的理由得出结论,机械拉伸可能通过 p38 MAPK/ATF3 途径调控表达。
ACE2 是 ATF3 的直接转录目标靶点
ACE2 的表达可能通过调节 ATF3 的表达和位置而受到机械拉伸的调节。为了进一步确定 ATF3 是否可以调控 ACE2,实验使用 JASPAR 数据库分析了 ACE2 启动子序列中潜在的 ATF3 结合位点。最终数据表明, ACE2 是 ATF3 的直接转录靶点。为验证 miRNAs 是否参与 ACE2 表达的调控,采用 Dicer siRNA 干扰 Dicer 酶的表达,阻断 miRNAs 的合成。在研究中发现,miR-421 的水平在 18% 的机械拉伸下增加,因此,在以下实验中重点关注 miR-421。接下来实验证实,miR-421 直接靶向 ACE2-3'-UTR。为了进一步验证 miR-421 对 ACE2 表达的影响,用 miR-421 模拟物、抑制剂或 NC 序列转染VSMCs。上述结果表明 miR-421 通过直接结合 3'-UTR 负向调控 ACE2 的表达。然而,miR-421 是否参与拉伸调节的 ACE2 仍是未知数。在用 miR-421 抑制剂转染 VSMCs 后,实验评估了机械拉伸下 ACE2 的表达。miR-421 抑制剂显著减弱了拉伸诱导的 ACE2 表达的下调。这些结果表明,miR-421 参与了机械拉伸对 ACE2 表达的调控。
机械牵张可能通过 p38 MAPK/ATF3 途径促使 ATF3 易位进入细胞核,从而降低保护因子 ACE2 的水平,并通过 miR-421 的转录后调控直接与 ACE2 启动子结合。
总之,实验数据显示,病理性机械拉伸通过 p38 MAPK/ATF3 通路和 miR-421 的转录后调节抑制 ACE2 的表达,促进了高血压过程中的 VSMC 功能障碍和血管重塑。更好地了解 ACE2 在血管重塑发展中的作用可能为临床医生提供开发新疗法的机会。
参考文献:Liu X, Liu X, Li M, Zhang Y, Chen W, Zhang M, Zhang C, Zhang M. Mechanical Stretch Induces Smooth Muscle Cell Dysfunction by Regulating ACE2 via P38/ATF3 and Post-transcriptional Regulation by miR-421. Front Physiol. 2021 Jan 18;11:540591. doi: 10.3389/fphys.2020.540591. PMID: 33536929; PMCID: PMC7848200.
原文链接:https://pubmed-ncbi-nlm-nih-gov.proxy.library.carleton.ca/33536929/
图片来源:所有实验过程图均来源于参考文献
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