AMP 激活的蛋白激酶调节糖萼损伤和巨噬细胞募集以响应低剪切应力

内皮糖萼由糖胺聚糖组成，包括透明质酸（HA）、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素和唾液酸，是一种位于内皮细胞顶端表面的糖蛋白复合物。该层有助于血管壁的屏障特性，并参与机械感应和剪切力到内皮的转导。

剪切应力是指血流与血管内皮间摩擦力。高剪切应力（HSS，12-15 dyn/cm²）已被证明可以维持内皮糖萼的完整性并抵抗早期动脉粥样硬化病变的发展。然而，低剪切应力（LSS，<5 dyn/cm²）也被认为通过减少内皮糖萼的尺寸在早期动脉粥样硬化中起关键作用。

研究发现，LSS 通过透明质酸酶2（HYAL2）途径降解内皮糖萼内的 HA，并进一步证明 LSS 诱导的糖萼损伤导致 eNOS-Ser633 去磷酸化并减少 NO 产生。然而，LSS如何激活HYAL2仍不清楚。Na⁺-H⁺交换剂(NHE1)催化细胞内H⁺离子的排出以交换细胞外Na⁺离子，是可能的候选者之一，并且是一种普遍存在的膜蛋白，可调节细胞pH值。有研究发现，NHE1被激活以产生酸性细胞外微环境，导致HYAL2在人乳腺肿瘤细胞中激活。据报道，在内皮细胞中，HSS可引发AMPK磷酸化并增加AMPK的活性，AMPK在调节细胞内pH值中起重要作用。AMPK是否通过细胞外基质的NHE1酸化参与LSS诱导的HYAL2活化仍有待确定。

因此，南京医科大学南京第一医院心内科的专家学者进行了研究，使用功能丧失方法和AMPKα、NHE1和HYAL2的激活或失活，旨在确定LSS诱导的内皮糖萼损伤和早期内皮炎症对LSS的影响和分子机制。文章为《AMP-activated protein kinase regulates glycocalyx impairment and macrophage recruitment in response to low shear stress.》

图1 平行平板流动室示意图
实验中的LSS为2 dyn/cm²，HSS为15 dyn/cm²。

NHE1 介导 LSS 诱导的糖萼损伤

LSS激活NHE1的机制是否涉及AMPK，以及NHE1在LSS诱导的糖萼损伤中的作用尚不清楚。实验首先在细胞经受LSS 5、15、30和60min后检查了NHE1蛋白及其磷酸化以及NHE1的活性。未经LSS处理的细胞用作对照。

尽管表面NHE1蛋白表达没有显著变化，但在LSS暴露15min后，NHE1磷酸化水平显著升高，在30min时达到最高水平。NHE1活性早在LSS处理后15min就增强并持续至少60min。

为了确认NHE1活性对响应LSS的糖萼损伤的影响，在LSS暴露之前，用编码显性阴性形式的酶 (AdDN-NHE1) 的腺病毒转导HUVECs，或用靶向NHE1活性的cariporide（卡立泊来德）预处理。使用AdDN-NHE1抑制NHE1活性显著降低了 LSS诱导的NHE1磷酸化和NHE1活性。除了AdDN-NHE1外，cariporide也可抑制NHE1活性。

接下来，使用AFM检查内皮糖萼厚度（GCT）。糖萼的最大厚度为628nm。LSS显著稀释了内皮糖萼，然而，使用AdDN-NHE1可抑制NHE1活性，或cariporide保护糖萼免受LSS诱导的GCT降低。

AMPK调节NHE1依赖性糖萼损伤以响应LSS

实验显示了AMPKα在其激活位点Thr172磷酸化的下调，伴随着AMPK活性的降低，这在LSS处理后15min就很明显，并且持续了至少60min。相反，AMPKα蛋白表达无明显变化。为了检查AMPK的失活是否介导LSS诱导的NHE1活化和糖萼降解，在没有或存在AMPK激活剂ampkinone的情况下，将HUVECs暴露于LSS30min。在接受30minLSS的细胞中，用ampkinone处理恢复了AMPKα-Thr172磷酸化水平以及被LSS下调的 AMPK 活性。Ampkinone处理还阻止了响应 LSS的NHE1磷酸化和NHE1活性的增加。

在平行实验中，在LSS暴露前30min用AdCA-AMPKα转导HUVECs。组成型活性AMPKα不仅恢复了由LSS抑制的AMPK活性，而且减弱了LSS诱导的NHE1磷酸化和NHE1活化。然而，使用AdDN-NHE1抑制NHE1活性既不会减弱AMPKα-Thr172去磷酸化，也不会逆转LSS诱导的AMPK失活。

接下来研究了AMPK在LSS诱导的HUVECs糖萼损伤中的作用。HUVECs与AMPK激活剂ampkinone的孵育显著减弱了LSS诱导的糖萼损伤。为了进一步证实AMPK活性对LSS下内皮糖萼损伤的影响，在HUVECs中表达了AdDN-AMPKα或AdCA-AMPKα。观察到AdCA-AMPKα保护糖萼免受LSS诱导的损伤。然而，AdDN-AMPKα显著逆转了HSS诱导的糖萼保护。结果显示cariporide、ampkinone、AdDN-NHE1和AdCA-AMPKα显著阻止糖萼中HA表达降低和糖萼变薄以响应LSS。这些结果表明LSS引起的AMPK失活介导了内皮糖萼损伤。

之前的研究表明，HYAL2参与了响应LSS的糖萼损伤。在该实验中，研究人员证实了LSS激活HYAL2降解内皮糖萼。上述结果表明，LSS诱导的内皮糖萼降解起因于AMPK失活和NHE1活化。实验接下来研究了AMPK和NHE1对LSS刺激的HUVECs中HYAL2活化的作用。结果发现，AMPK和NHE1轴调控LSS诱导的HYAL2活化。最后，实验证明Ampkinone处理可防止LSS诱导的左颈总动脉狭窄小鼠糖萼尺寸减少，并且保护内皮糖萼延缓左颈总动脉狭窄小鼠内皮炎症的发展。

总之，这项研究的结果表明，暴露于LSS的内皮细胞中AMPK的去磷酸化可能有助于NHE1的激活。后者被认为是一种离子通道蛋白，催化细胞内 H⁺ 离子和下调细胞外pH值。酸活性HYAL2降解内皮糖萼中的HA，导致内皮糖萼变薄。实验进一步发现糖萼损伤导致粘附分子VCAM-1和ICAM-1的表达增加，以及巨噬细胞募集到左颈动脉-PL小鼠的内皮细胞。因此，特定的糖萼保存，例如刺激AMPK，可能是一种预防早期内皮炎症和抑制动脉粥样硬化病变形成的新策略。

参考文献：Zhang J, Kong X, Wang Z, Gao X, Ge Z, Gu Y, Ye P, Chao Y, Zhu L, Li X, Chen S. AMP-activated protein kinase regulates glycocalyx impairment and macrophage recruitment in response to low shear stress. FASEB J. 2019 Jun;33(6):7202-7212. doi: 10.1096/fj.201801869RRR. Epub 2019 Mar 12. PMID: 30860864.
原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30860864/

图片来源：所有图片均来源于参考文献

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